В МГУ изучили возможности нанопорового секвенирования для сборки генома
Возможности нанопорового секвенирования (ONT), являющегося новым методом определения нуклеотидных последовательностей, изучили сотрудники кафедры физической химии и кафедры химии природных соединений химфака МГУ, 23 ноября сообщает пресс-служба университета.
Результаты исследования ученые представили в статье «Нанопоровое секвенирование для сборки бактериального генома de novo и поиска однонуклеотидного полиморфизма», опубликованной в International Journal of Molecular Sciences.
Авторы установили необходимые для получения достоверных результатов секвенирования параметры изучаемого образца и программные инструменты, дающие наиболее точные результаты.
Секвенирование устанавливает последовательность нуклеотидов в молекуле, что дает возможность решать разнообразные задачи по определению генома. Метод ONT в ряде случаев можно применять вместо обычного секвенирования.
Секвенирование позволяет определить произошедшие из-за той или иной болезни мутации в ДНК или следить за генетическими изменениями в бактериях, приводящими к устойчивости бактерий к антибиотикам.
Нанопоровое секвенирование — новый и активно развивающийся метод биотехнологии. От «стандартного» секвенирования метод ONT отличается тем, что он позволяет достаточно быстро читать длинные цепочки с тысячами нуклеотидных оснований. Соавтор исследования, профессор кафедры физической химии химфака МГУ Мария Хренова рассказала о цели проведенного исследования:
«Поскольку для нас этот метод тоже был новым, мы хотели систематически изучить его реальные возможности. Особенно нас интересовала сборка генома без референсной последовательности. Когда есть геном сравнения, то все просто — результаты секвенирования накладываются на него, можно сравнить их и заметить, где в геноме произошли изменения. Для этого достаточно меньшего набора данных и меньше требования к качеству образца».
Однако, когда референтного образца для сравнения нет, в результате исследователь имеет только набор прочитанных с разной степенью достоверности нуклеотидов. В этом случае похожие последовательности накладываются и в случае их частичного совпадения в разных цепочках можно сделать вывод о составе последовательности в целом.
Но для достоверного определения прочитанные участки должны быть достаточно большими — вот тут и проявляют себя достоинства нанопорового секвенирования.
Оно выполняется с помощью прибора, внутри которого находится мембрана со вставленными белками. Белки создают поры, через которые при приложении напряжения проходят ионы и секвенируемая молекула.
В момент прохождения через пору цепочки нуклеотидов каждый нуклеотид частично перекрывает пору, изменяя скорость движения ионов, то есть величину тока. Поскольку у каждого нуклеотида объем различный, то и изменение тока также будет разным. Изучая эти изменения, можно понять, какой именно нуклеотид прошел в данный момент через пору, и таким способом установить последовательность нуклеотидов в цепочке.
«Такой прибор стоит гораздо дешевле аналогов и более доступен, — пояснила Мария Хренова. — Проблема в том, что зачастую прочтение характеризуется достаточно большим количеством ошибок. Это могут быть несколько единиц и даже десятков процентов».
Чтобы изучить возможности нанопорового секвенирования, исследователи выяснили, при каких условиях ошибка прочтения становится минимальной: как должен быть устроен образец для сборки генома, какими должны быть длины цепочек, а также необходимое количество прочитанных оснований.
Изучая реальные образцы с известной последовательностью нуклеотидов и генерируя разные наборы данных, ученые сравнивали результаты анализа, выполненного несколькими программами.
«В результате мы выработали рекомендации, которым точно можно верить. Это очень важно для всех дальнейших исследований. Оказалось, у метода достаточно много возможностей, он является в высокой степени универсальным», — рассказала Мария Хренова.
Исследование проводилось в рамках проекта «Анализ микробиомов растений и беспозвоночных животных экстремальных мест обитания с целью разработки штаммов-продуцентов новых метаболитов и ферментов».
